蛋白質(zhì)保存全知道:穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性的科學(xué)指南
蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)扮演著極為重要的角色,它們參與細(xì)胞的構(gòu)建、催化化學(xué)反應(yīng)、傳遞信號等多種生理過程。在實(shí)驗(yàn)室研究、生物技術(shù)應(yīng)用以及生物制藥等領(lǐng)域,蛋白質(zhì)也是關(guān)鍵的研究對象和生產(chǎn)原料。然而,蛋白質(zhì)在制備、保存和使用過程中卻面臨著諸多挑戰(zhàn),如容易出現(xiàn)聚集、沉淀和變性等問題,這些問題會嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的活性與功能,進(jìn)而影響相關(guān)研究和應(yīng)用的準(zhǔn)確性與有效性。
一、影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素
(一)劇烈刺激
蛋白質(zhì)對環(huán)境變化較為敏感,pH 值的大幅波動、溫度的急劇升降、反復(fù)凍融循環(huán)、攪拌以及過濾等操作都可能成為破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的 “元兇"。攪拌會使蛋白質(zhì)暴露于空氣 - 水界面,過濾則讓其處于液體 - 固體界面,而 pH 值與溫度的劇烈變化更是直接干擾蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的化學(xué)鍵,這些因素綜合起來極有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使其原本有序的結(jié)構(gòu)變得松散無序,最終形成沉淀而失去活性。
(二)氨基酸側(cè)鏈變化
蛋白質(zhì)中的某些氨基酸側(cè)鏈容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng),進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性。像甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基具有較高的氧化敏感性,一旦被氧化,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能便會受到損害。此外,天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用以及肽主鏈肽基團(tuán)的切割也較為常見,這些變化會改變蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變甚至喪失。
二、蛋白質(zhì)的保存原則
(一)減少蛋白酶影響
蛋白酶猶如一把 “剪刀",能夠催化蛋白質(zhì)和多肽的水解反應(yīng),將它們切割成更小的片段。由于蛋白酶廣泛存在于各種環(huán)境中,在蛋白質(zhì)制備的初始階段就必須考慮如何降低其對目標(biāo)蛋白質(zhì)的破壞作用。可以選用蛋白酶缺陷的菌株來生產(chǎn)蛋白質(zhì),從源頭上減少蛋白酶的含量;在破菌純化蛋白的第一步就及時加入蛋白酶抑制劑,抑制胞內(nèi)蛋白酶的活性;同時,使用經(jīng)過嚴(yán)格滅菌處理且無雜質(zhì)污染的槍頭、緩沖液等耗材,避免其他微生物來源的蛋白酶混入樣品中。值得一提的是,如果目的蛋白以包涵體形式存在,由于其特殊的結(jié)構(gòu),能夠在一定程度上抵御蛋白酶的攻擊,降低被破壞的風(fēng)險。
(二)低溫保存
低溫環(huán)境對于蛋白質(zhì)來說就像是一個 “保護(hù)罩"。低溫能夠顯著降低蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動,減少分子內(nèi)部化學(xué)鍵斷裂的可能性。同時,低溫還能抑制微生物的生長繁殖,降低蛋白酶的活性,從而為蛋白質(zhì)的保存創(chuàng)造有利條件。對于短期保存(1 周以內(nèi)),通常將蛋白質(zhì)置于 4°C 的環(huán)境中較為適宜;而對于長期保存(數(shù)月至數(shù)年),則需要更低的溫度,如 -20°C 或 -80°C。不過需要注意的是,-20°C 冰箱在實(shí)際使用過程中,由于頻繁開關(guān)門,尤其是靠近冰箱門的區(qū)域,溫度波動較大,很難穩(wěn)定維持在 -20°C,甚至在無霜冰箱中還可能出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象,這對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性極為不利。此外,-20°C 接近某些鹽的共融點(diǎn),容易導(dǎo)致晶體反復(fù)凍融,進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)變性。因此,在條件允許的情況下,-80°C 是更為理想的長期保存溫度選擇。
(三)分裝保存
蛋白質(zhì)在冷凍保存與使用過程中存在一個棘手的問題,那就是反復(fù)凍融。每次凍融都會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷,導(dǎo)致其活性逐漸喪失或發(fā)生變性。為了減少這種損傷,將純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分裝保存是一種有效的策略。一般建議每管分裝 50 至 100 微升,具體可根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度以及實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,但每管最少不應(yīng)低于 10 微升。在使用時,僅解凍本次實(shí)驗(yàn)所需的部分,并且盡量控制凍融次數(shù)不超過兩次。對于實(shí)驗(yàn)剩余的蛋白質(zhì),如果短期內(nèi)還會使用,可暫時存放在 4°C 冰箱中,但存放時間不宜超過一周。
(四)控制濃度
蛋白質(zhì)的濃度過高或過低都會引發(fā)一系列問題。當(dāng)濃度過高時,蛋白質(zhì)分子之間的相互作用增強(qiáng),容易發(fā)生聚集并沉淀下來;而當(dāng)濃度過低(低于 0.1mg/mL)時,蛋白質(zhì)又會特異性地吸附在管壁上,造成蛋白質(zhì)的損失,從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。因此,在保存蛋白質(zhì)時,需要將其濃度控制在一個合適的范圍內(nèi),一般建議濃度為 1 - 10mg/mL。
(五)速凍與速融
緩慢的冷凍過程會使蛋白質(zhì)處于一種極為 “惡劣" 的環(huán)境中,可能會使其暴露在高鹽濃度高 pH 條件下,這種環(huán)境會嚴(yán)重破壞蛋白質(zhì)的活性。因此,在冷凍蛋白質(zhì)時,應(yīng)采用快速冷凍的方法,如使用液氮或干冰 / 乙醇 / 丙酮混合物進(jìn)行速凍,讓蛋白質(zhì)能夠迅速越過危險的溫度區(qū)間,減少損傷。同樣,在解凍時也需要讓蛋白質(zhì)快速恢復(fù)到適宜的鹽濃度和 pH 條件下,例如可以像復(fù)蘇細(xì)胞一樣,將蛋白質(zhì)樣品置于 37°C 的溫水中快速解凍。
(六)合理使用添加劑
在蛋白質(zhì)保存過程中,添加劑的使用需要謹(jǐn)慎選擇,必須確保所添加的試劑不會對蛋白質(zhì)的活性產(chǎn)生負(fù)面影響。
緩沖液:緩沖液能夠維持溶液的 pH 值穩(wěn)定,一般選擇 pH 在中性范圍內(nèi)(如 50 mmol/L pH8.0 的 Tris - HCl 或 PBS),鹽濃度在 0 - 150mmol/L 的緩沖液較為合適。合適的緩沖液可以為蛋白質(zhì)提供一個相對穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境,減少 pH 值波動對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。
保護(hù)劑:不同的保護(hù)劑具有不同的功能。甘油(濃度為 10% - 50%)可以防止蛋白質(zhì)在冷凍過程中受到損傷,避免因凍融而導(dǎo)致的變性;Na2N2(濃度為 0.02% - 0.1%)能夠有效抑制細(xì)菌的生長繁殖,但需要注意的是,Na2N2會干擾某些抗體蛋白參與的氨基反應(yīng),在這種情況下,可以使用 0.01% 的硫柳汞來替代;PMSF 作為一種蛋白酶抑制劑,可以防止蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解作用;DTT 則是一種還原劑,能夠防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)。然而,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時,由于Na2N2和硫柳汞可能對生物體產(chǎn)生毒性,因此不可添加這兩種物質(zhì),通常采用過濾除菌的方法來保證蛋白質(zhì)溶液的無菌性。
三、蛋白質(zhì)的保存策略
(一)液體狀態(tài)下不凍結(jié)保存
在液體狀態(tài)下短期保存蛋白質(zhì)時,可以將溫度控制在 2 - 8°C,在這個溫度區(qū)間內(nèi),蛋白質(zhì)能夠保持相對穩(wěn)定,減少聚集沉淀的發(fā)生,但需要注意的是,即使在這個溫度下,蛋白質(zhì)仍然會發(fā)生緩慢的化學(xué)降解反應(yīng)。為了進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,需要調(diào)節(jié)溶液的 pH 值,使其維持在 5.5 - 7.5 的穩(wěn)定范圍內(nèi)。此外,由于蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的去折疊傾向,可以添加一些非特異性穩(wěn)定劑,如 0.5M 的蔗糖,它能夠與蛋白質(zhì)分子相互作用,增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。還可以添加硫酸銨、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖等添加劑,這些添加劑通過優(yōu)先排阻的方法維持蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性,其中檸檬酸鹽緩沖液(在不存在鈣離子的情況下)效果較為顯著。溶液中離子的電荷屏蔽作用能夠降低蛋白質(zhì)分子間的電荷 - 電荷排斥作用,但離子濃度的選擇需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。
(二)凍結(jié)溫度下保存
在選擇凍結(jié)溫度保存蛋白質(zhì)時,-80°C 相較于 -20°C 具有明顯優(yōu)勢。-80°C 能夠更大程度地降低蛋白質(zhì)的降解速率,為蛋白質(zhì)提供更好的長期保存條件。而 -20°C 冰箱由于其自身特點(diǎn),如頻繁開關(guān)門導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定,特別是在無霜冰箱中易出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象,且接近某些鹽的共融點(diǎn),容易造成晶體反復(fù)凍融,從而引起蛋白質(zhì)變性。在緩沖液的選擇上,由于低溫下堿性鹽容易結(jié)晶,酸性鹽仍可溶解,冷凍時磷酸鹽緩沖液 pH 值會大幅下降,這可能導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此,應(yīng)優(yōu)先選擇檸檬酸鹽、Tris、組氨酸等緩沖液,以減少 pH 值變化對蛋白質(zhì)的影響。同時,加入甘油、鹽析鹽、二糖(濃度高于 0.3M)、表面活性劑(濃度低至 0.1%)等保護(hù)劑,能夠有效防止蛋白質(zhì)在冷凍過程中發(fā)生變性和沉淀;添加百分之幾的 BSA 或聚合物也可以抑制冷凍引起的蛋白質(zhì)去折疊;適當(dāng)增加蛋白質(zhì)的起始濃度,能夠增強(qiáng)其在凍融過程中對損傷的耐受性。
(三)凍干保存
凍干是一種較為特殊且有效的蛋白質(zhì)保存方法,它通過將溶劑或懸浮介質(zhì)在低溫下冷凍,然后使固態(tài)的溶劑直接升華為氣態(tài),從而去除水分,得到干燥的蛋白質(zhì)樣品。這種方法能夠很好地保持蛋白質(zhì)物質(zhì)骨架的穩(wěn)定性,并且在復(fù)融后其結(jié)構(gòu)和功能基本不發(fā)生改變。凍干過程主要包括預(yù)凍結(jié)、升華干燥和解析干燥三個階段。在凍干過程中,添加必要的穩(wěn)定劑對于防止蛋白質(zhì)變性至關(guān)重要,其中非還原型的海藻糖和蔗糖(濃度為 200 - 300mM)作為穩(wěn)定劑對蛋白質(zhì)的保護(hù)較好。需要注意的是,應(yīng)避免使用還原型糖,如葡萄糖、麥芽糖、乳糖等,因?yàn)樗鼈儠l(fā)美拉德(Maillard)反應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。目前,商業(yè)化的蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品通常采用添加海藻糖 5%、甘露醇 5%、tween - 80 0.01% 的方法來保護(hù)蛋白質(zhì)。然而,凍干方法也存在一些不足之處,例如凍干設(shè)備復(fù)雜且昂貴,這使得凍干成本較高;某些蛋白質(zhì)在凍干后可能無法全復(fù)溶,或者在凍干 / 復(fù)溶過程中會受到損傷,導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性下降。因此,凍干通常作為蛋白質(zhì)保存的最后選擇,只有在其他保存方法無法滿足需求時才考慮使用。
四、蛋白質(zhì)保存的注意事項(xiàng)
(一)SDS - PAGE 檢測
在蛋白質(zhì)保存過程中,如果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)活性有所下降或丟失,首先應(yīng)進(jìn)行 SDS - PAGE 跑膠檢測。SDS - PAGE 是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù),它能夠根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小將其分離,通過跑膠結(jié)果可以直觀地觀察蛋白質(zhì)是否發(fā)生了降解,從而幫助我們初步判斷蛋白質(zhì)活性丟失的原因,為后續(xù)采取相應(yīng)的措施提供依據(jù)。
(二)無菌操作
我們的皮膚表面存在著各種蛋白酶以及其他化學(xué)物質(zhì),這些物質(zhì)很容易污染蛋白質(zhì)樣品,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性。因此,在進(jìn)行蛋白質(zhì)相關(guān)操作時,務(wù)必戴上手套,避免皮膚直接接觸蛋白質(zhì)溶液;同時,使用經(jīng)過滅菌處理的小管來保存蛋白質(zhì),防止微生物污染,確保蛋白質(zhì)處于一個無菌的環(huán)境中。
(三)避免震蕩
震蕩過程中產(chǎn)生的剪切力以及氣泡中的氧氣會對蛋白質(zhì)造成雙重傷害。剪切力可能破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),而氧氣則容易引發(fā)蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性喪失。因此,在蛋白質(zhì)的制備、保存和使用過程中,應(yīng)盡量避免劇烈震蕩,保持操作的平穩(wěn)性。
蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對于眾多生物學(xué)研究和生物工程應(yīng)用具有舉足輕重的意義。了解影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種因素,并遵循科學(xué)合理的保存原則、策略以及注意事項(xiàng),能夠幫助我們有效地保持蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)穩(wěn)定,延長其保存時間,確保蛋白質(zhì)在研究和應(yīng)用中發(fā)揮其應(yīng)有的作用。
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