近些年來，隨著PCR技術的出現，以及DNA克隆和測序方法的發展，對大量質粒載 體和重組子的需求也大大減少。
  在本方案中，通過 堿裂解法的放大（Birnboim and Doly 1979）,質粒DNA可從清亮的細菌裂解物中通過含有 漠化乙錠的CsCl梯度離心來進行純化。
  無論是高拷貝數的質粒還是低拷貝數的質粒，通過這種方法可以得到每毫升3?5^g 的DNA。重組子的質粒一般產量較少，這取決于克隆的DNA片段的大小和特點。
材料
為正確使用本方案中的器材和危險試劑，必須查閱相應的材料安全數據表并咨詢所在機構的環境衛生和安全辦公室。
儲備溶液應稀釋至適用濃度后使用。
試劑
瓊脂糖凝膠（見步驟8和19）
堿裂解液I<A>
若用柱層析進一步純化所制備的質粒DNA （見本章導言中"純化DNA的商業試劑盒”部分），無菌的堿裂解 液I在使用前可補充適當體積的無DNA酶的RNA酶（20mg/mL,胰RNA酶），使終濃度為lOOpg/mL,若用其他 方法純化DNA,不推薦在此步驟中加RNA酶。
堿裂解液II<A>
現配現用，室溫使用。
堿裂解液III<A>
用于篩選質粒的抗生素
轉化了目的質粒的細菌克隆
氯霉素（34mg/mL）（可選；見步驟4）
乙醇
異丙醇
溶菌酶（10mg/mL）
限制性內切核酸酶
培養基（LB、YT 或者 Terrific Broth） <A>,預熱到 37°C
STE<A>,冰浴
TE （pH8.0） <A>
附加試劑
步驟8和步驟19需要第2章方案1中列出的試劑。步驟18需要柱層析所用材料（見 本章導言）。
設備
有蓋的培養瓶（125mL, 2L）
知楚搖床，預設到37°C
RC6 Plus離心機帶轉頭，合適容量（Thermo Scientific）
分光光度計
實驗方法
細胞制備

• 挑取轉化的細菌單菌落或用0.1?l.OmL單菌落的培養物，接種到30mL含有適當 抗生素的培養基中（LB、YT或者Terrific Broth）o

為確保培養物通氣良好：
?試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大4倍。試管蓋要蓋得松些。
•培養物要在劇烈振蕩下培養。

• 在適當的溫度和搖速下培養菌液直至對數生長期晚期（OD6oo約為0.6）。

• 在含有500mL的LB、YT或者Terrific Broth培養液（預熱到37°C ）及適當抗生素 的燒瓶（2L）中接種25mL對數生長期晚期的菌液。將此培養液在37°C劇烈振蕩（300cycles/ min）,培養 2.5h»

最后菌液的ODao應為0.4。由于不同菌株的生長速度不同，可稍微延長或縮短培養時間，使最終的OD值為0.4。

• 若質粒為低或中拷貝數的質粒，在培養液中加2.5mL濃度為34mg/mL的氯霉素， 使其終濃度為170ng/mLo

A對于高拷貝數質粒，不必添加氯霉素。

• 在 37°C 以 300cycles/min 振蕩 12~16h。

• 取部分菌液（1?2mL）到離心管中，4°C儲存。2700g離心15min以收集余下的近 500mL培養物。棄上清，倒置離心管使殘余上清流出。

• 用200mL冰預冷的STE重懸細菌沉淀，按步驟6所述重新收集細菌并儲存在-20°C。

• 采用方案1中的方法或使用商品化試劑盒，從步驟6中取出的1?2mL菌液中提取 質粒，并釆用酶切和瓊脂糖電泳分析此少量制備的質粒DNA,以確定大量培養菌液中獲得 的質粒正確。

設置這種對照可能看上去有點過于謹慎，然而它可以避免發生某些難以挽回的、浪費大量時間的錯誤。
細胞裂解

• 將步驟7中凍存的細菌在室溫下放置5?lOmin使其解凍，用18mL （10mL）堿裂 解液I重懸。

如果步驟4中使用了氯霉素的菌液，則使用括號中的體積數。
10. 加2mL （ImL）新配制的10mg/mL溶菌酶。

• 加40mL （20mL）新配制的堿裂解液II。蓋上離心管蓋，輕輕顛倒數次，混 勻，室溫放置5~10min。

延長超螺旋DNA暴露于堿的時間會使其不可逆變性，所產生的環狀卷曲DNA不能被限制酶切割，而且它在 瓊脂糖電泳中的遷移率為正常超螺旋DNA的2倍，難以被漠化乙錠染色。從細菌中用堿裂解法提質粒時可能會看 到微量的這種DNA.

• 加20mL （15mL）冰浴冷的堿裂解液III。蓋上離心管蓋，輕輕地但振蕩混勻 （此時不應再有兩個液相）。將離心管在冰上放置lOmino

在放置過程中會出現由染色體DNA、高分子質量RNA,鉀離子、SDS、蛋白質、細胞壁復合物一起形成的乳 白色沉淀。
在堿裂解液HI中最好使用乙酸鉀而非乙酸鈉，因為十二烷基乙酸鉀鹽比鈉鹽難溶•
13. 4°C用＞20 000g離心30min,讓轉子自動停止，無須制動。將上清輕輕移入量筒中， 棄去沉淀。
不能形成緊密沉淀的原因一般是加入堿裂解液II時沒有充分混勻（步驟ID.如果細菌碎片不能形成緊密的 沉淀，以20 OOOg再次離心15min,將上清移入干凈的離心管。轉移時可用4層紗布過濾上清，可以除去黏稠的基 因組DNA和蛋白質沉淀。
質粒DNA回收

• 量取上清體積，將其連同0.6倍體積的異丙醇一起移入一支干凈離心管中并將其 充分混勻，室溫下放置lOmin。

15. 在室溫下以12 OOOg離心15min回收核酸沉淀。
若在4莒離心會使鹽沉淀下來。

• 小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾除去殘余上清。在室溫下用70%乙 醇涮洗管壁，倒掉乙醇，并除去管壁的液滴。將離心管開口倒置于紙巾上使剩余乙醇揮發掉。

如果用干燥器或者真空干燥的方法干燥DNA沉淀，在某些情況下會使其難以溶解并可能變性（Svaren et al. 1987）.將沉淀在室溫下干燥10~15min使乙醇揮發就足夠，不會引起DNA脫水。

• 用3mL含有2.0卩g/mL無DNA酶的RNase A的TE （pH 8.0）溶解DNA沉淀。輕 柔振蕩溶液。將DNA保存于-20°C O

18. 質粒DNA的純化可用商業樹脂進行柱層析（如QIAGEN公司的QIA-prep）。
19. 用DNA測序及限制性酶切結合凝膠電泳分析確證質粒結構。

疑難解答
問題（步驟19）：由于質粒毒性使質粒DNA得率低（W1.0卩g/mL）。

解決方案：換成低拷貝數的質?；驍y帶原核生物轉錄終止信號的載體。

問題（步驟19）：在酶切前、后經電泳只見很少或無DNA。
解決方案：在乙醇沉淀后，在步驟16中可能將核酸丟失。離心后馬上小心地去除乙醇, 如果離心管放置的時間太長，DNA沉淀會與管壁分離。

問題（步驟19）： DNA不能被限制酶切割。
解決方案：DNA不能切割，可能是沒有移去所有液體，在純化質粒DNA的過程中， 有些成分阻礙限制酶的功能?？梢試L試以下建議：

• 在步驟6中移去所有液體。

• 在步驟7中移去所有STEo

• 在步驟16中移去所有液體。

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